1.
Judul Praktikum :
Penentuan Kadar
Betakaroten Metode Spektrofotometri
2.
Tanggal Praktikum :
Sabtu, 26 Mei 2012
3.
Tujuan Praktikum :
Menentukan kadar betakaroten pada daun
singkong serta mengetahui
pembentukan kurva standar beta karoten.
4.
Prinsip
Analisa
kadar betakaroten dengan metode spektrofotometri berdasarkan aktivitas serapan
molekul betakaroten terhadap sinar pada panjang gelombang tertentu. Merupakan
penentuan banyaknya provitamin A didasarkan pada absorbansinya pada panjang
gelombang 436 nm (β-karoten).
5.
Reaksi :
Chlorofil + KOH alkohol à flavonoid + chlorofil sisa
Flavonoid + eter à karoten + flavonoid sisa
Karoten + eter + etanol à β-karoten
6.
Tinjauan Pustaka :
Istilah karotena digunakan untuk menunjuk ke beberapa
senyawa yang berhubungan yang memiliki formula C40H56.
Karotena adalah pigmen fotosintesis berwarna jinggayang penting
dalam fotosintesis. Zat ini
membentuk warna jingga dalam wortel dan banyak buah dan sayur lainnya. Dia berperan dalam fotosintesis
dengan menyalurkan energi cahaya yang dia serap ke klorofil.
Secara biokimia, karotena
terasuk dalam golongan terpena, yang
disintesis secara biokimia dari delapan satuan isoprena. Ia dikenal
dalam dua bentuk utama yang diberi karakter Yunani: alfa-karotena (α-karotena) dan beta-karotena (β-karotena). Gamma-, delta-, dan
epsilon- (γ, δ, dan ε-karotena) juga dikenal dalam jumlah yang sedikit.
Beta-karotena terdiri dari dua grup retinil, dan dipecah dalam mukosa dari usus kecil oleh beta-karotena
dioksigenase menjadi retinol, sebuah
bentuk dari vitamin A]. Karotena
dapat disimpan dalam hati dan diubah menjadi vitamin A sesuai kebutuhan, sehingga ia dapat
dianggap sebagai provitamin.
Dalam sel tumbuhan, karotena
ditemukan di dalam plastida tersendiri yang terpisah dari kloroplas, dan disebut kromoplas karotena. Organel ini tidak ditemukan pada selain tumbuhan hijau.
Beta Carotene dikenal
sebagai provitamin A, karena beta carotene adalah salah
satu prekursor terpenting untuk pembentukan vitamin A. beta carotene akan dikonversi menjadi vitamin A dengan bantuan enzim yang
selanjutnya akan dioksidasi menjadi senyawa aldehid "all trans retinal" kemudian akan
mengalami isomerisasi geometri dalam ikatan rangkap C 11 dan C12 untu
menghasilkan 11 cis
retinal, senyawa
inilah yang sensitif terhadap sinar.
Beta-karoten adalah salah satu jenis senyawa hidrokarbon karotenoid
yangmerupakan senyawa golongan tetraterpenoid (Winarsi, 2007). Adanya
ikatanganda menyebabkan beta-karoten peka terhadap oksidasi. Oksidasi
beta-karotenakan lebih cepat dengan adanya sinar, dan katalis logam,
khususnyatembaga, besi dan mangan. Oksidasi akan terjadi secara acak pada
rantai karbonyang mengandung ikatan rangkap. Beta-karoten merupakan penangkap
oksigendan sebagai antioksidan yang potensial, tetapi beta-karoten efektif sebagaipengikat
radikal bebas bila hanya tersedia oksigen 2– 20 %. Pada tekananoksigen tinggi diatas kisaran fisiologis,
karoten dapat bersifat pro-oksidan (Burton, 1989).
Buah dan sayuran selain mengandung
vitamin dan mineral, juga mengandung pigmen yang menyebabkan kenampakan sayur
dan buah berwarna-warni yang menarik. Salah satu pigmen yang ada dalm sayuran
adalah pigmen karoten. Pigmen ini memberikan warna kuning hingga oranye pada
bahan. Contoh bahan yang banyak mengandung pigmen jenis ini adalah daun singkong, ubi, labu besar kuning,
dan jagung. Pigmen karoten
terdiri atas beberapa macam, salah satunya adalah betakaroten. Betakaroten ini berfungsi sebagai antioksidan, penting
dalam pembentukan vitamin A, untuk pertumbuhan sel-sel epitel tubuh, mengatur
rangsang sinar pada saraf mata, dan membantu pembentukan pigmen di retina mata.
Kandungan betakaroten dalam bahan hasil pertanian juga berbeda-beda dan untuk
menentukan kadar betakaroten dalam bahan dapat dilakukan dengan teknik
spektrofotometri.
Karoten merupakan salah satu senyawa pigmen dari tumbuhan
ataupun hewan yang memiliki struktur polyene yaitu senyawa organik
dengan atom karbon berantai lurus memiliki ikatan rangkap. Pada hewan,
karotenoid terikat pada lipid sebagai lipochrone. Sedangkan pada tumbuhan
karotenoid terdapat sebagai pigmen berwarna kuning atau oranye. Betakaroten
merupakan senyawa yang bersifat larut dalam lemak, tidak larut dalam air, mudah
rusak karena teroksidasi pada suhu tinggi, dan menjadi penyusun vitamin A.
Betakaroten berfungsi sebagai antioksidan, penting dalam
pembentukan vitamin A, untuk pertumbuhan sel-sel epitel tubuh, mengatur
rangsang sinar pada saraf mata, dan membantu pembentukan pigmen di retina mata.
Secara kimia, karoten
adalah terpena,
disintesis secara biokimia dari delapan satuan isoprena. Dia ada
dalam dua bentuk utama yang diberi karakter Yunani: alfa-karoten (α-karoten)
dan beta-karoten (β-karoten). Gamma, delta, dan
epsilon (γ, δ dan ε-karoten)
juga ada. Beta-karoten terdiri dari dua grup retinil, dan dipecah dalam mukosa dari usus kecil oleh beta-karoten dioksigenase menjadiretinol, sebuah
bentuk dari vitamin A. Karoten
dapat disimpan dalam hati dan
diubah menjadi vitamin A sesuai kebutuhan, dan membuatnya menjadiprovitamin.
Pigmen karotenoid dapat mengalami proses kerusakan atau
degradasi karena beberapa faktor, yaitu ikatan rangkap karotenoid mudah
teroksidasi oleh oksigen sehingga akan dihasilkan epoksi (keton); degradasi
pada jembatan ikatan isoprene ditengah, bukan pada ring ionone; adanya
pemanasan akan dapat merusak mol karotenoid sehingga warna dan potensi vitamin
A berubah
Ada 3 macam karotenoid, yaitu a-karoten yang tidak memiliki gugus metil pada ujung
molekulnya, a-karoten dan β-karoten yang
memiliki 2 atom ring ionone penuh dan ¶-karoten yang salah satu ring iononenya terbuka
lycopene (tidak memiliki ring ionone).
Spektrofotometri adalah sebuah metode analisis untuk mengukur
konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi
berkas sinar atau cahaya. Spektrofotometri adalah alat yang terdiri dari
spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari
spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah alat
pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorpsi (Riyadi 2008).
Istilah spektrofotometri berhubungan dengan pengukuran energi
radiasi yang diserap oleh suatu sistem sebagai fungsi panjang gelombang dari
radiasi maupun pengukuran panjang absorpsi terisolasi pada suatu panjang
gelombang tertentu (Underwood 1994).
Spektrum elektromagnetik terdiri dari urutan gelombang dengan
sifat-sifat yang berbeda. Kawasan gelombang penting di dalam penelitian
biokimia adalah ultra lembayung (UV, 180-350 nm) dan tampak (VIS, 350-800 nm).
Cahaya di dalam kawasan ini mempunyai energi yang cukup untuk mengeluarkan
elektron valensi di dalam molekul tersebut (Keenan 1992).
7.
Alat dan Bahan :
Bahan
:
|
|
Alat :
·
Spatula
·
Erlenmeyer
·
Water Bath
·
Gelas Ukur
·
Kertas Saring
·
Labu seukuran
·
Batang pengaduk
·
Corong
|
·
Sentrifuge
·
Penyangga saringan kayu
·
Spektofotometer
·
Pipet tetes
·
Gelas Penalar
·
Kapas
·
Timbangan analitik
·
Gelas Kimia
|
8.
Prosedur Praktikum :
1. Siapkan alat dan bahan yang akan
digunakan, lalu cuci bersih alat dan bahan yang digunakan agar tidak ada
kontaminasi dari bahan-bahan lain yang tidak diinginkan yang akan mempengaruhi
hasil akhir.
2. Sampel yang sudah dihaluskan ditimbang
sebanyak 10 gr dalm erlenmeyer.
3. Tambahkan 50 mL KOH alkohol 10%.
4. Panaskan bahan yang telah tercampur
KOH alkohol 10% pada penangas air selama 30 menit.
5. Setelah 30 menit tambahkan alkohol
panas.
6. Dinginkan sampel pada erlenmeyer
menggunakan air mengalir pada bagian luar sampel hingga tidak terasa panas pada
bagian dalamnya, lalu saring filtrat dengan menggunakan kertas saring dan
usahakan residu sampel tidak ikut tersaring kedalam filtrat tersebut.
7. Lalu tambahkan 50 mL eter (2x
pencucian) ke dalam residu sampel, lalu kocok kembali tabung erlenmeyer.
8. Masukkan filtrat hasil penyaringan
kedalam labu kenala.
9. Buang larutan yang berwarna hijau
hingga tersisa larutan yang berwarna kuning yang terdapat pada bagian atas.
10. Tambahkan 15 mL eter pada larutan
warna kuning yang telah disaring tersebut, lalu tambahkan 50 mL aquades.
11. Lakukan penyaringan/pembuangan kembali
hingga hanya warna kuning jernih yang tersisa.
12. Baca warna yang terbentuk pada
spektofotometer dengan menggunakan panjang gelombang 436 nm.
13. Membuat larutan standar : larutkan 1
mL larutan karoten murni dalam labu seukuran 100 mL dengan menggunakan methanol
hingga tanda batas, lalu homogenkan.
14. Lihat nilai absorban pada larutan
tersebut dengan menggunakan spektofotometer pada panjang gelombang 436 nm.
9.
Hasil Praktikum dan Perhitungan :
Berat sampel :
10,0332 gram
Larutan standar: 1 ml
larutan dalam 100 ml alkohol
Panjang gelombang
larutan sampel dan standar
Ulangan ke-
|
Sampel
|
Standar
|
1
|
3,784
|
0,074
|
2
|
3,785
|
0,075
|
3
|
3,785
|
0,074
|
4
|
3,785
|
0,071
|
Rata-rata
|
3,785
|
0,074
|
Klmpk
|
Karoten Murni untuk Standar
|
Absorban standar pada λ = 436 nm
|
Bahan Sampel
|
Absorban Sampel pada λ = 436 nm
|
1
|
1 mL
|
0,074 A
|
Daun Singkong
|
3,785 A
|
2
|
2 mL
|
0,102 A
|
0,1245 A
|
|
3
|
3 mL
|
0,120 A
|
3,180 A
|
|
4
|
4 mL
|
0,156 A
|
3,773 A
|
|
5
|
5 mL
|
0,183 A
|
Wortel
|
0,533 A
|
6
|
6 mL
|
0,218 A
|
0,244 A
|
|
7
|
7 mL
|
0,221 A
|
0,623 A
|
|
8
|
8 mL
|
0,242 A
|
0,332 A
|
10.
Pembahasan
Hasil :
Prosedur
kerja dimulai dari menumbuk bahan berupa daun singkong smpai cukup halus
sehingga memudahkan proses analisa dan ekstraksi. Kemudian ditambahkan KOH
alkohol sebanyak 50 mL ke dalam erlenmeyer. Erlenmeyer tidak boleh terkena
sinar matahari karena akan terjadi proses oksidasi. Fungsi penambahan KOH
alkohol adalah untuk mengekstraksi atau melarutkan betakaroten daun singkong
sehingga mudah dianalisis. Hal ini dilakukan karena betakaroten merupakan
pigmen yang hanya larut dalam pelarut organik non polar. Setelah itu distirer
selama 10 menit agar proses ekstraksi betakaroten daun singkong oleh KOH
alkohol berlangsung optimal. Kemudian sampel tersebut disaring dan dimasukkan
ke dalam labu dan kembali ditambahkan larutan KOH alkohol 10 mL sampai warna
kuning atau oranye menghilang yang menandakan bahwa pigmen betakaroten
pembentuk warna kuning atau oranye pada daun singkong sudah benar-benar
larut/terekstraksi sempurna dalam pelarut. Penambahan larutan KOH alkohol yang
kedua kalinya ini bertujuan untuk mengekstraksi atau melarutkan betakaroten
daun singkong yang belum ikut terekstraksi pada waktu sebelumnya sehingga
dengan begitu diharapkan betakaroten yang ada dalam daun singkong sudah
terekstraksi semuanya secara optimal tanpa tersisa dan siap dianalisis. Setelah
itu larutan sampel ditera dengan aquades sampai 50 mL. Hal ini dilakukan agar
sampel tidak terlalu pekat saat dilakukan pembacaan absorbansi karena pembacaan
absorbansi tidak akan berlangsung optimal jika larutan sampel yang dianalisa
terlalu pekat. Kemudian larutan sampel yang sudah ditera siap diukur nilai
absorbansinya pada panjang gelombang 436 nm. Pembacaan nilai absorbansi
dilakukan dengan menggunakan panjang gelombang 436 nm karena pada panjang
gelombang tersebut, molekul betakaroten dapat menyerap sinar secara optimal
sehingga dihasilkan nilai pembacaan absorbansi yang jelas dan tepat. Prinsip
pembacaan absorbansi ini adalah berdasarkan aktivitas serapan molekul
betakaroten terhadap sinar pada panjang gelombang tertentu, yaitu 436 nm.
Setelah diketahui nilai absorbansinya, maka dapat dihitung kadar betakaroten
dalam sampel daun singkong.
Berdasarkan
hasil perhitungan diketahui bahwa rata-rata kadar betakaroten daun singkong
adalah senilai 3,785 A. Sedangkan kadar betakaroten standar yang telah dibuat
adalah 0,074 A. Faktor kesalahan yang mungkin terjadi selama praktikum adalah
kadar protein yang dihasilkan dari hasil analisis terlalu kecil sehingga kurang
sesuai dengan literatur. Hal ini disebabkan karena pada saat ekstraksi,
betakaroten dalam daun singkong tidak terekstraksi semua secara optimal
sehingga masih ada betakaroten yang tidak terekstraksi dan betakaroten yang
berhasil diekstraksi lalu dianalisis jumlahnya hanya sedikit sehingga kadar
betakaroten yang terukur hasilnya kecil, bisa juga karena pengaruh saat
pembacaan nilai absorbansi yang kurang cermat atau kurang teliti.
11.
Kesimpulan :
Dari hasil praktikum didapatkan
berat daun singkong yang ditimbang sebesar 10,0332 gram. Untuk penentuan nilai
absorbansi betakaroten dari sampel berupa daun singkong maupun berupa larutan
standar dilakukan empat kali pengulangan. Untuk mendapatkan larutan betakaroten
sampel dilakukan dua kali ekstraksi. Ekstraksi pertama didapatkan dua lapisan
warna larutan, lapisan atas berwarna hijau kekuningan dan larutan bagian bawah
berwarna hijau tua. Larutan hijau tua dibuang dan larutan bagian atas dibiarkan
untuk kemudian ditambahkan eter. Setelah penambahan eter kembali akan terbentuk
lagi dua lapisan warna, lapisan bawah berwarna kekuningan dan lapisan atas
berwarna kuning jernih seperti minyak. Larutan inilah yang akan dilihat nilai
absorbansinya. Untuk rata-rata nilai absorbansi sampel yaitu sebesar 3,784 A.
Sedangkan rata-rata nilai absorbansi dari larutan standar yaitu sebesar 0,074
A.
12.
Daftar
Pustaka :
Winarno, F. G. 1991. Kimia Pangan dan Gizi.
Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama
